Die Sicherheit der Fahrgäste hat bei der RegioBus höchste Priorität. Einmal jährlich werden alle Fahrzeuge der RegioBus einer Hauptuntersuchung unterzogen, die vom TÜV oder der Dekra durchgeführt wird. Zudem wird bei Fahrzeugen, die älter als drei Jahre alt sind, eine vorgeschriebene vierteljährliche Sicherheitsprüfung durchgeführt. Insbesondere die Bremsen, das Fahrwerk, das Licht, die Lenkung und die Reifen werden kontrolliert.

Die RegioBus verlässt sich aber nicht allein auf die gesetzlichen Bestimmungen: Jeder Bus wird zusätzlich alle sechs Wochen mit modernster Prüftechnik gewartet. Auch bei den geringsten Unregelmäßigkeiten führt die RegioBus vorbeugende Reparaturen aus. Das Fahrpersonal trägt vorhandene Mängel in ein Bordbuch ein, die dann schnellstmöglich in der Werkstatt beseitigt werden. Reifen werden bereits ab einer Profiltiefe unter drei Millimetern ausgewechselt – gesetzlich ist ein Mindestprofil von 1,6 Millimetern vorgeschrieben.

Um zu gewährleisten, dass die Linienbusse immer auf dem neuesten Stand sind, ersetzt die RegioBus ihre Fahrzeuge in der Regel nach etwa zwölf Jahren.

Alle Busfahrer der RegioBus werden in regelmäßigen Fahrsicherheitstrainings des ADAC auf besondere Situationen im Straßenverkehr vorbereitet, damit sie auch dann richtig reagieren, wenn sicherheitstechnische Vorkehrungen alleine nicht mehr ausreichen, zum Beispiel bei extremen Straßenverhältnissen.